Ghirlandaio pintó la escena de la Última Cena en varias ocasiones en el lapso de unos pocos años. En las tres obras suyas que aún quedan, la disposición básica es la misma que en el fresco de Andrea del Castagno en Florencia Cenacolo di Sant'Apollonia data de alrededor de 1450. Los discípulos están sentados en una larga mesa frente a una pared trasera que corre paralelo al plan de imagen. Cristo está sentado en el centro, y su favorito discípulo Juan se inclina tristemente contra él. A la derecha de Cristo, en el lugar de honor, es el apóstol principal, Peter. Judas el traidor es el único que se separaron de los demás: está sentado en frente de la tabla.
El ejemplo más antiguo de la Última Cena fue pintada en 1476 por Ghirlandaio en la abadía de San Michele Arcangelo un Passign ano (en Tavernelle Val di Pesa, cerca de Florencia). Esto está fuertemente influenciada por Andrea del Castagno. Los apóstoles y Cristo están sentados juntos en una habitación con un techo plano, que parece ser muy baja. Judas está sentado enfrente de Cristo en un taburete de tres patas, delante de la mesa puesta. Las cifras son un retroceso a cierta distancia de nosotros, a una profundidad de tres baldosas de gran tamaño. Las diversas emociones de los Apóstoles se indican mediante movimientos de la mano dura que apenas parecen estar vivas y expresar algo del carácter de los individuos.